RNA干扰端粒酶反转录酶基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.11.014

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (11): 1724-1729.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.11.014

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

RNA干扰端粒酶反转录酶基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

宋扬¹，徐韬¹，杨明坤²，王国旗¹，张恩丰¹，盛伟斌¹

¹新疆医科大学第一附属医院脊柱外科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；²四川省巴中市中心医院骨科，四川省巴中市 636600

修回日期:2014-02-25 出版日期:2014-03-12 发布日期:2014-03-12
通讯作者: 盛伟斌，博士，教授，主任医师。新疆医科大学第一附属医院脊柱外科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:宋扬，男，1986年生，陕西省汉中市人，汉族，新疆医科大学第一附属医院在读硕士。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81060106)

Construction and identification of recombinant lentivirus expressing small interfering RNA against human telomerase reverse transcriptase gene

Song Yang¹, Xu Tao¹, Yang Ming-kun², Wang Guo-qi¹, Zhang En-feng¹, Sheng Wei-bin¹

¹Department of Spine Surgery, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; ²Department of Orthopedics, Bazhong Central Hospital, Bazhong 636600, Sichuan Province, China

Revised:2014-02-25 Online:2014-03-12 Published:2014-03-12
Contact: Sheng Wei-bin, M.D., Professor, Chief physician, Department of Spine Surgery, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Song Yang, Studying for master’s degree, Department of Spine Surgery, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81060106

摘要/Abstract

摘要：

背景：端粒酶反转录酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)对端粒酶活化起重要作用，但利用构建针对其基因的慢病毒抑制其在脊髓星形胶质细胞中的表达却少有报道。

目的：构建用于RNA干扰的靶向大鼠脊髓源星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的慢病毒载体，并观察其对端粒酶反转录酶表达的抑制作用。

方法：通过设计合成出shRNA-TERT序列，经聚合酶链反应扩增后定向连接到pLentilox3.7U6载体上构建重组质粒，经转染DH5α细胞筛选阳性菌落后行测序鉴定。将pLentilox3.7U6-TERT重组质粒转染293T细胞，包装产生重组慢病毒Le-TERT并测定其滴度，再用Le-TERT感染大鼠脊髓星形胶质细胞，实时定量-聚合酶链反应检测各细胞株TERT基因表达水平，并利用Western blot和免疫荧光分别检测TERT蛋白的表达。

结果与结论：基因测序鉴定证明，pLentilox3.7U6-TERT重组质粒构建成功，并成功包装慢病毒。实时定量PCR、Western blot和免疫荧光检测结果表明，Le-TERT转染星形胶质细胞4 d后，对TERT mRNA的干扰效率可达(63.98±2.6)%，Le-TERT在转然后的星形胶质细胞中呈低表达。结果证实，实验构建的重组表达载体pLentilox3.7U6-TERT能够产生有效滴度的慢病毒，感染大鼠脊髓星形胶质细胞后，该载体可以有效抑制TERT的表达。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 组织构建基础实验, RNA干扰, 端粒酶, 端粒酶反转录酶, 质粒载体, 慢病毒, 星形胶质细胞, 短发夹RNA, 脊髓损伤, 胶质瘢痕, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Telomerase reverse transcriptase (TERT) plays an important role in telomerase activation, however there is rare report addressing the construction of the lentivirus targeted its genes to inhibit its expression in the spinal cord astrocytes.

OBJECTIVE: To construct recombinant lentivirus vector expressing small interfering RNA against TERT gene and to evaluate its potential for inhibiting the TERT expression.

METHODS: After shRNA-TERT sequence was designed and synthesized, the sequence was amplified by PCR and then connected to plasmid pLentilox3.7U6-hTERT to construct recombinant plasmid. The recombinant plasmid was then transfected to DH5α cells to screen positive colony, and the sequence was identified. The recombinant plasmid pLentilox3.7U6-TERT was transfected in 293T cells, generating recombinant lentivirus Le-TERT. The titer of recombinant lentivirus was determined and Le-TERT was transfected into the rat spinal cord astrocytes. The expression of TERT in astrocytes was detected by RT-PCR, western blot and immunofluorescence assay.

RESULTS AND CONCLUSION: The gene sequencing analysis confirmed that, recombinant plasmid pLentilox3.7U6-TERT was successfully constructed. The real-time quantitative PCR, western blot analysis and immunofluorescence assay indicated that, after Le-TERT was transfected in the astrocytes for 4 days, the inhibition rate of TERT mRNA was (63.98±2.6)%, and Le-TERT was lowly expressed in the transfected astrocytes. Recombinant expression vector pLentilox3.7U6-TERT can produce the lentivirus at high titer and effectively inhibit TERT expression in the transfected astrocytes.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: transfection, gene expression, cells, plasmid

中图分类号:

R394.2

宋扬，徐韬，杨明坤，王国旗，张恩丰，盛伟斌. RNA干扰端粒酶反转录酶基因慢病毒表达载体的构建及鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(11): 1724-1729.

Song Yang, Xu Tao, Yang Ming-kun, Wang Guo-qi, Zhang En-feng, Sheng Wei-bin. Construction and identification of recombinant lentivirus expressing small interfering RNA against human telomerase reverse transcriptase gene[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(11): 1724-1729.

图/表（结果） 1

参考文献

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引言

材料方法

设计：基因学实验。

时间及地点：于2013年8月至10月在新疆医科大学第一附属医院医学研究中心完成。

材料：

实验动物：健康清洁级雄性SD大鼠4只，体质量(200±50) g，由新疆医科大学医学动物实验中心提供，动物许可证号：SYXK(新)2003-001。实验对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》^[2]。

载体：pLentilox3.7U6质粒载体购自广州Cyagen公司。

细胞：大鼠脊髓源星形胶质细胞由实验室在新疆医科大学医学第一附属医院医学研究院细胞研究所指导下分离纯化。大肠杆菌DH5α和293T细胞由新疆医科大学医学研究院第一附属医院细胞研究所提供。

方法：

shRNA序列的设计与合成：按照pLentilox3.7U6中启动子U6表达siRNA的要求，参考GenBank中提供的大鼠TERT基因核苷酸序列(序列号AY539718.1；大小3 360 bp；种属：大鼠)，使用Ambion公司的siRNA Target finder软件设计3条编码siRNA的DNA片段，命名为shRNA-TERT1，shRNA-TERT2和shRNA-TERT3。任一编码siRNA的DNA片段的随机组合序列设为阴性对照序列，命名为shRNA-Contral。以间隔序列连接干扰片段正向和反向序列，分别在两端加入限制性内切酶HpaⅠ和XhoⅠ酶切位点。经序列Blast分析，避免与大鼠其他基因的同源性。由上海生工合成编码小干扰RNA的DNA序列。靶向大鼠星形胶质细胞TERT基因的shRNA靶序列及对照序列见表1。

pLentilox3.7U6-TERT 载体的构建和鉴定：根据所设计的大鼠shRNA-TERTA1，shRNA-TERTA2，shRNA-TERTA3和shRNA-Contral序列，分别化学合成各自的正向和反向的DNA oligos并稀释至终浓度为100 μmol/L，按PCR试剂盒相关说明配制PCR反应体系，短暂离心后放入PCR仪扩增。HpaⅠ和XhoⅠ内切酶双酶切pLentilox3.7载体(氨苄抗性)使其线形化。然后将酶切产物电泳分离，回收纯化后将质粒质量浓度调整为0.5 g/L。将线性化载体和PCR扩增产物在T₄ DNA 连接酶作用下持续连接16 h。经热休克法使连接产物转化DH5α感受态细胞，37 ℃条件下，在氨苄抗性的固态培养基平板上培养大约16 h后，挑取多个阳性菌落至氨苄抗性的培养基中培养后进行测序鉴定，由上海生工完成。

TERT-shRNA慢病毒包装：转染前24 h将293T细胞接种于培养皿中培养，转染前2 h再换用高糖DMEM新鲜培养基(不含抗生素，含FBS)，保持转染时细胞融合度为70%-80%。取稀释纯化的shRNA和慢病毒包装系统质粒(pPL1，pPL2，VSV-G，Puromycin载体)置于Opti-MEM I Reduced Serum Medium中混匀。混匀LipofectamineTM2000稀释于1.5 mL不含血清的Opti-MEM I Reduced Serum Medium中，室温孵育5 min，分别把上述TERT慢病毒质粒和LipofectamineTM2000混合，室温下孵育20 min。再把上述各组质粒与Lipofectamine^TM2000的混合液加入293T细胞中，混匀后放入细胞培养箱，37 ℃、体积分数5% CO₂孵育转染细胞8 h后，换用新鲜完全培养基继续培养48 h后收集上清。经PEG-8000浓缩病毒后加入适量的慢病毒溶解液将慢病毒溶解沉淀；用碎干冰速冻后储存在-80 ℃冰箱中。所得病毒命分别名为Le-TERT1，Le-TERT2和Le-TERTC。

慢病毒滴度检测：用DMEM培养基重悬293细胞至1×10⁷ L^-1，在96孔板按100 μL/每孔加入重悬细胞。按10倍体积用DMEM倍比稀释10 μL病毒颗粒6次后加入96孔板中。37 ℃孵育8 h后，更换为含10%FBS的培养液培养72 h后在倒置荧光显微镜下技术GFP表达细胞，按慢病毒滴度公式计算病毒滴度。

慢病毒滴度=(P×N/V)×DF，其中P∶GFP阳性细胞数；N∶感染细胞总数；V=病毒稀释液体积；DF=病毒稀释倍数。

Le-TERT感染星形胶质细胞株：原代培养SD大鼠星形胶质细胞病毒感染前24 h接种于6孔板中，每孔细胞再换用900 μL DMEM-F12新鲜培养基(不含抗生素，含体积分数10% FBS)、100 μL病毒液和终浓度为8 mg/L的hexadimethrine bromide病毒感染增强液，感染细胞过夜后换用新鲜培养基，37 ℃、体积分数5% CO₂孵育感染细胞72-96 h后病毒基因可整合到宿主细胞的基因组序列，同时，目的基因表达量达到高峰并趋于稳定。收集细胞用其做后续实验。

实时PCR检测星形胶质细胞株TERTmRNA表达：提取上述细胞总RNA后，采用一步法行实时PCR反应：引物序列见表2。

反应体系(25 μL)：SuperMix12.5 μL、正义引物0.5 μL、反义引物0.5 μL，Passive Reference Dye 0.5 μL，cDNA 2 μL、ddH₂O 9 μL。程序如下：95 ℃ 3 min；95 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s共40循环；95 ℃ 15 s；60 ℃ 15 s；60-95 ℃ 20 min；95 ℃15 s，之后用2^-△△Ct法计算各组干扰效率并将数据导入GraphPad Prism 5.01软件采用单因素方差分析获得柱状图。

Western blot检测星形胶质细胞株TERT蛋白的表达：感染后96 h收集干扰组和对照组细胞，用细胞裂解液获得细胞总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，Western blot检测TERT蛋白的表达，β-actin作为内参。具体操作：取制备好的蛋白样品，各样本之间平衡后，沸水煮5 min，12 000 r/min离心2 min，每泳道上样45 μL。浓缩胶60 V，分离胶100 V，溴酚蓝移动至玻璃板底端，提示电泳结束，关闭电源。用PVDF膜100 V，转膜90 min，冰上进行；体积分数1% BSA 封闭1 h，分别用鼠抗β-actin单克隆抗体、羊抗大鼠TERT多克隆抗体孵育过夜，PBST洗膜4次，每次10 min。HRP标记的兔抗鼠IgG或兔抗羊IgG室温孵育1 h，PBST洗膜4次，每次10 min。用ELC化学发光法显色，所有步骤按说明书操作。

免疫荧光检测星形胶质细胞株TERT表达：待星形胶质细胞稳转细胞株生长至80%融合时，弃去培养基，然后用40 g/L多聚甲醛在室温条件下固定细胞15 min；PBS冲洗后在4 ℃条件下，用体积分数0.1%Triton X-100透膜15 min；在室温条件下，用体积分数4% BSA封闭细胞30 min；按1∶100的比例稀释TERT一抗，然后将其放在4 ℃冰箱中孵育过夜；按1∶100的比例稀释抗TERT的PE二抗，37 ℃条件下放置1 h；最后在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

主要观察指标：重组TERT-shRNA干扰分子表达载体序列；实时PCR、蛋白印迹和免疫荧光分别对比Le-TERT1，Le-TERT2和Le-TERTC干扰TERT表达的效果。

统计学分析：计量资料用x(_)±s表示，GraphPad Prism 5.01软件进行数据分析，组间均数差异的比较采用两样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

脊髓损伤后损伤区星形胶质细胞由常态转化为反应态，细胞内胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic portein，GFAP)表达增加，是参与胶质瘢痕形成的重要物质基础^[3-4]，是脊髓损伤后的标志性病理变化^[5]，周围神经组织隔离，阻碍再生的神经轴突通过损伤区，而且产生抑制神经再生的化学分子，阻碍残存的神经轴突的胶质瘢痕将损伤区与再髓鞘化，形成阻碍神经再生的化学屏障^[6-8]。

研究发现，在脊髓损伤后损伤区的胶质瘢痕形成过程中，端粒酶的活性明显提高。作者课题组之前的研究表明，端粒酶在脊髓胶质瘢痕中呈动态表达并与衡量胶质瘢痕程度的胶质纤维酸性蛋白呈正相关线性关系，可能是促进胶质瘢痕形成的重要因素^[9]。这与之前发现的在于许多细胞永生化改变过程中端粒酶激活相一致，例如端粒酶是恶性肿瘤细胞、胶质瘤细胞持续增殖、无限生长的必要条件。端粒酶是一种核酸蛋白质复合物，它是由互补于端粒DNA的RNA亚基(telomeraseRNA，TR)和具有反转录酶活性的TERT及端粒酶相关蛋白(telomere associated protein 1，TP1)组成。其中TERT作为端粒酶的一个关键亚单位，是端粒酶活性的限速决定子^[10]，其表达不仅与端粒酶的活性密切相关，而且其水平上调是端粒酶被激活的关键步骤^[11]。因此，作者的实验设计通过抑制TERT表达来抑制端粒酶的激活，从而减轻脊髓损伤区胶质瘢痕的形成，达到促进脊髓损伤后神经功能恢复的目的。

目前，抑制细胞内特定基因表达的方法主要包括反义技术、RNAi及核酶技术等。其中RNAi是近些年广泛应用的基因阻断技术，RNAi是一种双链RNA分子在mRNA水平上关闭序列基因或使其沉默的过程，也就是序列特异性的转录后基因沉默。主要在转录后水平上实现其干预作用，其作用原理为：外源DNA或RNA引起细胞产生dsRNA，dsRNA由核酸内切酶作用裂解成21-23 nt的正义和反义序列祖正的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNA)。siRNA的反义链形成一种有内切酶构成的复合体：沉默诱导复合物(RNA-inducing silencing complex, RISC)。RISC利用其内切活性切割靶mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域，达到干扰基因表达的目的。这种技术已经成为研究基因功能的重要工具，在病毒性疾病、遗传性疾病、肿瘤和脊髓损伤的治疗方面发挥重要作用^[12]。目前，siRNA的制备方法主要有：化学合成法、体外转录法、鸡尾酒法和载体法。其中载体法通过构建质粒或病毒表达载体，转入细胞后使目的基因得到长期抑制，效果较好，是目前常用的研究方法。

实验设计靶向TERT基因的小发夹RNA(small hairpin RNA, shRNA)，利用含有U6启动子pLentilox3.7载体构建相应的pLentilox3.7U6-TERT重组质粒来包装慢病毒，用该病毒感染星形胶质细胞后经细胞内酶作用形成相应的siRNA，siRNA构成RISC复合体，后者在其含有的内切酶作用下将TERT mRNA切断^[13-15]，达到干扰作用，此后，在RNA依赖的RNA聚合酶作用下，正义链以自身为模板合成新的双链RNA，并将RNAi作用不断放大^[16-17]，从而达到抑制目的基因表达的作用。

设置实验阳性和阴性对照组是衡量 RNA干扰实验数据真实度的一个重要因素。设立阳性对照是为了通过在不同浓度检测 siRNA 转染效率，以及最后的干扰效果，来明确适宜的转染条件和最低的但有效的siRNA 浓度。研究表明：RISC复合物中各组分具有饱和性，siRNA过多可能是引起细胞毒性和死亡的原因。

对于许多细胞来讲，看家基因(如β-actin和GAPDH等)是常用的阳性对照，他们在细胞内不受外界的影响而稳定表达，这些基因的对应siRNA序列已在相关试验中得到广泛应用。本次实验中，选择了管家基因β-actin作为基因表达干扰过程中的阳性对照，从而使得qRT-PCR和Western blot中对TERT的抑制效果更加真实可信。阴性对照的目的是检测RNA干扰的特异性。通常，阴性对照的 siRNA 序列与设计的siRNA 序列有相同碱基组成，但与目的 mRNA 无明显同源性。阴性对照的siRNA序列设计有两种方法，一是打乱特异性siRNA的序列，即“混乱”siRNA(scrambled siRNA)，并且对其进行BLAST 序列分析，防止其与目的靶细胞中的相关基因存在同源性；另一种方法则是在特异性 siRNA 序列中插入数量不定的错配碱基。若插入的是单个的碱基错配，应需考虑突变 mRNA(即SNP位点)与它的结合能力，并且在设计 siRNA 时就提前规避突变位点。

本次实验采用前一种方法，参照shRNA-TERT1序列，将shRNA-TERT1序列乱序后重排，将任一编码siRNA的DNA片段的随机组合序列设计为无干扰效果的阴性对照序列，命名为shRNA-Contral。并且经过序列Blast分析，与大鼠现有的基因文库比对，避免其与大鼠其他基因的同源性。

与其他常用的病毒类载体比较，反转录病毒载体存在的问题在于其病毒滴度较低，而且只能感染处于分裂期的细胞^[18]，可容纳外源基因的DNA片段长度较短；腺病毒载体在感染细胞时，病毒DNA向宿主染色体整合效率较低，从而不能实现长期稳定的表达，且有报道发现其在多次应用后引起免疫反应，因而这两种病毒载体都有其相对的局限性而影响其广泛应用^[19]。

慢病毒载体是以人类免疫缺陷1型病毒为基础发展起来的基因治疗载体。属于反转录病毒科，其基因组结构复杂，带有除一般反转录病毒包含的3个结构基因外的4个辅助基因和2个调节基因^[20]，因而区别一般的反转录病毒载体，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力是其主要优点^[21]，并能在更为广泛的宿主细胞内长期表达，产生高滴度的慢病毒，具有较好的安全性^[22]。慢病毒构建的原理是将人类免疫缺陷1型病毒基因组中的瞬时作用原件(如包装信号，长末端重复序列)和编码反式作用蛋白的序列进行分离。如上所述，慢病毒载体比传统的反转录病毒更广，与腺病毒相比又能够长期稳定表达，对多种细胞类型均具有良好的基因治疗应用前景。

实验通过分组设计和构建针对靶基因TERT的shRNA表达质粒重组体包装慢病毒，感染星形胶质细胞检测靶基因表达改变，筛选干扰效果好的病毒组为后续体外试验奠定基础。结果发现，Le-TERT可以高效感染星形胶质细胞并能在其中表达，使TERT基因在mRNA水平表达降低、TERT蛋白表达减少，获得了良好的抑制效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Construction and identification of recombinant lentivirus expressing small interfering RNA against human telomerase reverse transcriptase gene

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